供稿人:周佳佳、王玲 供稿單位：機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)布日期：2020-11-24
神經(jīng)回路的形成和發(fā)展在理解大腦機(jī)制方面起著關(guān)鍵作用。目前，研究人員已通過(guò)各種模型對(duì)神經(jīng)回路進(jìn)行了廣泛研究，如動(dòng)物模型和2D細(xì)胞培養(yǎng)模型，但由于動(dòng)物與人類的固有差異及2D與3D模型行為的不同，使其應(yīng)用受到限制。3D細(xì)胞打印作為一種新興的生物制造技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于體外組織研究，特別是神經(jīng)科學(xué)中的體外類腦組織構(gòu)建。
近期，清華大學(xué)與美國(guó)賓夕法尼亞州德雷塞爾大學(xué)研究人員提出了一種利用3D細(xì)胞打印技術(shù)制造的層狀體外類腦組織構(gòu)建體。該模型基于自然的大腦分層結(jié)構(gòu)，利用簡(jiǎn)化的三層結(jié)構(gòu)用作神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的人工3D環(huán)境，每層厚500μm，結(jié)構(gòu)面積8×8 mm2，并具有網(wǎng)格營(yíng)養(yǎng)支持系統(tǒng)，P01 Wistar大鼠皮質(zhì)初級(jí)神經(jīng)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞打印系統(tǒng)被引入結(jié)構(gòu)中。為模擬神經(jīng)細(xì)胞周圍環(huán)境，研究人員選擇并測(cè)試了由藻酸鹽、明膠和纖維蛋白原組成的生物墨水。交聯(lián)固化后，在樣品中加入補(bǔ)充有抑肽酶的新鮮培養(yǎng)基以保持打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。為提高細(xì)胞存活率，對(duì)噴嘴尺寸和打印速度進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)化，結(jié)果表明，噴嘴內(nèi)徑0.51mm、打印速度5ul·s-1是存活率為85%的優(yōu)化尺寸。
圖1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程的詳細(xì)說(shuō)明
打印結(jié)構(gòu)在體外培養(yǎng)4周，活/死細(xì)胞檢測(cè)表明，第0天后，細(xì)胞均勻分布在結(jié)構(gòu)內(nèi)部，存活率在85%左右。在第7～28天，材料和培養(yǎng)基接觸的邊緣區(qū)域逐漸開(kāi)始降解，但結(jié)構(gòu)彈性模量保持不變。細(xì)胞形態(tài)由圓形逐漸生長(zhǎng)為定向的細(xì)胞束，軸突逐漸伸展并構(gòu)建神經(jīng)元之間的連接，從而推動(dòng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成。
研究人員發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，從第7天開(kāi)始，3D樣品的凋亡率明顯低于2D樣品。此外，在相同的刺激條件下，3D樣品中的峰值為0.6mV，比2D樣品大一倍，其歸因于3D模型中神經(jīng)元可以沿z軸方向擴(kuò)展其生長(zhǎng)空間，更多的神經(jīng)元連接在膜電極組件周圍的網(wǎng)絡(luò)中，產(chǎn)生更大的LFP信號(hào)。
此外，根據(jù)TTX藥物測(cè)試，當(dāng)TTX被添加到培養(yǎng)物中時(shí)，可以穿透打印結(jié)構(gòu)并立即影響神經(jīng)元，EPSP(興奮性突觸后電位)信號(hào)顯著下降到零，這意味著神經(jīng)元活動(dòng)受到TTX的強(qiáng)烈影響。這一結(jié)果表明這種打印結(jié)構(gòu)在藥物篩選未來(lái)應(yīng)用中的巨大潛力。
圖2 (a-c)打印0天后的結(jié)構(gòu)形態(tài); (d-k)體外培養(yǎng)第7～28天打印結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)