供稿人：張?jiān)础⒏吡?供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)布日期：2024-01-19
心肌組織工程已成為治療心肌梗塞的一種有前途的治療策略。許多研究表明，結(jié)合干細(xì)胞、生物材料和生物工程的細(xì)胞化心臟補(bǔ)片/結(jié)構(gòu)可以防止梗死后重塑并修復(fù)受損的心肌，且具有各向異性肌纖維和血管化特征的心臟補(bǔ)片在動(dòng)物體內(nèi)可以有效增加細(xì)胞移植和物質(zhì)供應(yīng)。但擠出打印難以獨(dú)立實(shí)現(xiàn)組織構(gòu)建物的分層多尺度微制造，因此制造出具有各向異性肌纖維和可灌注的血管通道的厚心肌組織仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。
近日，重慶大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種利用定制光束掃描立體光刻打印技術(shù)（SL）和開(kāi)發(fā)的脫細(xì)胞外基質(zhì)微纖維增強(qiáng)明膠基生物墨水，制造具有各向異性肌纖維和可灌注的血管通道的厚心肌組織的技術(shù)，并展示了打印組織構(gòu)建物在治療心肌梗塞方面的潛力。
圖1 制備dECM纖維和dECM纖維增強(qiáng)生物墨水
將天然心肌脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）纖維與可光交聯(lián)的甲基丙烯酰化明膠（GelMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）混合，獲得心肌組織特異性生物墨水，如圖1a所示。圖1b和1c是對(duì)心肌組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理并制備生物墨水的過(guò)程。具體過(guò)程為：取8個(gè)月大的家豬心臟，用絞肉機(jī)絞碎后，用十二烷基硫酸鈉溶液（1 wt%）攪拌心肌組織48h，然后用Triton X-100溶液（1 wt%）處理1h。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）清洗dECM（每8小時(shí)一次）3-5天，使用抗生素抗真菌溶液將dECM滅菌24小時(shí)，然后用滅菌PBS沖洗3次。最后，將dECM凍干，在無(wú)菌條件下使用攪拌機(jī)粉碎成微纖維，得到dECM。研究中使用的光交聯(lián)生物墨水是由3 wt% dECM纖維、5 wt% GelMA、10 wt% PEGDA（Mn=700）和1 wt%光引發(fā)劑Irgacure 2959組成的。在進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)之前，將墨水溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.4，并劇烈搖動(dòng)墨水2h，使微纖維在墨水中完全溶脹并均勻分散。
圖2 3D打印具有可灌注血管的厚心肌組織并進(jìn)行體外表征
圖2a說(shuō)明所設(shè)計(jì)的各向異性肌纖維和可灌注血管通道來(lái)源于心臟的天然組織結(jié)構(gòu)。圖2b是使用dECM纖維增強(qiáng)生物墨水3D打印厚心臟組織構(gòu)件，構(gòu)件的尺寸約為2cm×2cm，厚度約為5mm，設(shè)計(jì)了六邊形微觀結(jié)構(gòu)來(lái)模擬天然心肌的纖維取向，圖案寬度為200μm，以40%的填充密度打印，相鄰層以45°的角度堆疊，此外還設(shè)計(jì)了直徑為1mm可灌注通道，嵌入到打印的構(gòu)件中。SL打印速度保持在1cm/s，激光強(qiáng)度為20kHz。圖2c是打印的構(gòu)件與人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hECs）和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）共培養(yǎng)一周后的圖像。如圖2d-2f所示，經(jīng)過(guò)7天的共培養(yǎng)，可以觀察到hiPSC-CMs聚集成密集的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)；同時(shí)，hECs在打印的厚構(gòu)造物頂部的肌纖維內(nèi)生成了微血管陣列。對(duì)心肌收縮蛋白（cTnI）和血管蛋白（vWf）的三維免疫染色研究表明，心肌細(xì)胞均勻地分布在3D打印構(gòu)件的六角形圖案纖維上，并帶有致密的hEC網(wǎng)絡(luò)。此外，用免疫染色法在打印的構(gòu)件上發(fā)現(xiàn)了hiPSC-CMs的F-肌動(dòng)蛋白和α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)，CD31染色血管的熒光圖像分析顯示，打印的大血管通道中hEC粘附密度更高。結(jié)果表明，制造出了具有各向異性的肌纖維，同時(shí)還生成了可灌注的大血管的構(gòu)件。
這項(xiàng)研究成功證明了SL打印在制造具有臨床相關(guān)尺寸的復(fù)雜三維仿生分層結(jié)構(gòu)的潛力；提供了一種新穎有效的用于治療心肌梗死的體外生成仿生心臟組織的方法，為有效修復(fù)受損的人體心肌組織和治療與心肌梗死相關(guān)的心血管疾病提供一種解決方法。