供稿人：彭思琦、孫暢寧 供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室 發(fā)布日期：2024-04-17
骨肉瘤是一種常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要影響兒童和青少年，由于其高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，骨肉瘤顯著影響患者的生活質(zhì)量和總生存期，目前骨肉瘤術(shù)后解剖重建和腫瘤切除后局部復(fù)發(fā)的預(yù)防是骨肉瘤治療的兩個重要臨床挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)能夠修復(fù)嚴(yán)重的骨缺損，并防止腫瘤復(fù)發(fā)新型功能化支架材料已成為當(dāng)前急需解決的問題。目前，3D打印鈦合金是一種公認(rèn)的具有更有效果的支架，因為其彈性模型更接近皮質(zhì)骨，與宿主骨的接觸面積更大，形狀設(shè)計更靈活，應(yīng)力屏蔽和對宿主骨的壓力更小（脊柱終板塌陷率更低），更適合大跨度、長節(jié)段、不對稱骨缺損的修復(fù)。然而，由于骨腫瘤患者接受3D打印鈦合金治療的預(yù)期壽命延長，許多問題仍有待解決，例如疲勞斷裂和局部腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加。因此，使其具有成骨和抗腫瘤特性是當(dāng)務(wù)之急。
最近發(fā)現(xiàn)辛伐他汀在骨生成和抗菌作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是治療骨肉瘤相關(guān)骨缺損的理想藥物。PLGA-PEG-PLGA水凝膠是一種常用的藥物載體，它也是一種可逆的熱敏性凝膠化，便于處理和易于應(yīng)用。然而，其力學(xué)強(qiáng)度不足以用作骨替代物。北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科的景澤浩醫(yī)生開發(fā)了一種辛伐他汀/水凝膠負(fù)載的3D打印鈦合金支架，評估其對兔髁突骨缺損模型和荷骨肉瘤裸鼠模型的成骨和骨肉瘤的影響。
本研究首先進(jìn)行3D打印鈦合金支架的制備，使用電子束熔化（EBM）S12系統(tǒng)進(jìn)行制備鈦合金支架，直徑5 mm × L 6 mm，孔徑640 μm，支柱直徑400 μm，并進(jìn)行辛伐他汀和水凝膠的搭載，分別制備了辛伐他汀最終濃度分別為0.5、1、1.25、2.5、5、10、15和20 mg/mL的支架Sim-3DTi。通過場發(fā)射電鏡（SEM）、能量色散光譜（EDS）等方式對于制備獲得的支架進(jìn)行了表征，并測定了其彈性模量和粘性模量。本研究中3DTi的物理參數(shù)證明3DTi的力學(xué)性能符合骨植入物的要求；在SEM圖像中，Sim-3DTi是一個實心圓柱體，由具有大孔金剛石晶格結(jié)構(gòu)的3DTi、具有微孔結(jié)構(gòu)的水凝膠和長度約為5-10 μm的棒狀辛伐他汀顆粒組成，3DTi的大孔可以容納水凝膠，水凝膠的微孔可以容納辛伐他汀顆粒，從而使Sim-3DTi成為穩(wěn)定的復(fù)合物；EDS分析揭示了碳和氧在Sim-3DTi表面上的元素富集，與鈦、鋁和釩的元素富集不同，進(jìn)一步驗證了3DTi和水凝膠的元素組成及其在Sim-3DTi中的緊密結(jié)合。
圖1 Sim-3Dti的制備與表征。(A)Sim-3DTi構(gòu)建方案示意圖；(B)Sim-3DTi、3DTi、PLGA-PEG-PLGA水凝膠和辛伐他汀顆粒的代表性SEM圖像；(C)Sim-3DTi的代表性EDS分層圖像和定量元素分析
接下來進(jìn)行生物性能測試，首先進(jìn)行Sim-3DTi體外抗骨肉瘤作用及生物安全性研究，通過進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量測定、細(xì)胞活力評定、細(xì)胞染色觀察等方式對細(xì)胞增殖、生長、分化、存活率進(jìn)行評估進(jìn)而對Sim-3DTi支架的體外生物性能進(jìn)行評估。實驗結(jié)果顯示辛伐他汀負(fù)荷存在最佳劑量范圍（2.5-5 mg/ mL），其可以降低骨肉瘤細(xì)胞的生存力，而不降低健康細(xì)胞的生存力。
圖2 Sim-3DTi生物安全性和體外抗骨肉瘤作用的辛伐他汀濃度篩選。(A) Sim-3DTi最佳辛伐他汀濃度生物安全性和抗骨肉瘤作用示意圖。(B-E)在與Sim-3DTi共培養(yǎng)后第1、5天L929和143 B細(xì)胞的細(xì)胞活力
接下來進(jìn)行Sim-3DTi體內(nèi)抗骨肉瘤作用及生物安全性研究，選用移植有腫瘤的大鼠作為動物實驗?zāi)Ｐ?，將支架皮下放置在每只小鼠的腫瘤附近，其中，植入3DTi的小鼠定義為對照組，而植入負(fù)載2.5 mg/mL和5 mg/mL辛伐他汀的Sim-3DTi的小鼠分別定義為Sim 2.5和Sim 5組。實驗結(jié)果顯示隨著Sim 3DTi中辛伐他汀負(fù)荷的增加，腫瘤體積顯著減小，且Sim 5具有更強(qiáng)的抑瘤作用。此外，在任何組中均未觀察到細(xì)胞變性或壞死。這些結(jié)果表明，Sim-3DTi可以發(fā)揮抗骨肉瘤作用，同時保持生物安全性。
另外同時進(jìn)行體內(nèi)成骨作用，選用新西蘭白色家兔，在股骨外側(cè)髁上創(chuàng)建直徑5 mm、深6 mm的圓柱形缺損，最終通過顯微計算機(jī)斷層掃描（micro-CT）成像、不脫鈣組織切片和BMP-2檢測骨生長情況。Micro-CT重建和切片顯示骨生成直接在植入物中和周圍，辛伐他汀負(fù)荷組種植體內(nèi)及周圍的骨生成顯著增加。兩個指標(biāo)（BV/TV，與成骨呈正相關(guān)，Tb.SP，與成骨呈負(fù)相關(guān)），使用micro-CT成像定量分析成骨。BV/TV值從Sim 5組到Sim 2.5組再到對照組呈下降趨勢，Tb.Sp則相反，表明辛伐他汀負(fù)荷促進(jìn)體內(nèi)骨生成；使用進(jìn)行Masson Goldner三色染色的未脫鈣切片來評價Sim-3DTi在體內(nèi)的骨內(nèi)生長和骨整合，隨著辛伐他汀的負(fù)載量從對照組增加到Sim 2.5和Sim 5組，連接到3DTi支柱的孔中的礦化骨的量顯著增加。同時，骨向內(nèi)生長和骨整合的程度也逐漸增強(qiáng)，證明了通過3DTi將辛伐他汀局部遞送到骨缺損的成骨作用。這些結(jié)果與micro-CT成像結(jié)果一致。
圖3 Sim-3DTi的體內(nèi)成骨作用。(A)使用顯微CT成像對ROI中的骨和植入物進(jìn)行重建（頂線）和切片（底線）。骨和植入物在頂行中分別為黃色和銀，而在底行中分別為灰色和白色。通過兩個指標(biāo)量化ROI中的骨生成：（B）骨體積/組織體積（BV/TV）和（C）骨小梁分離（Tb.Sp）
在本研究中使用溫度敏感的PLGA-PEG-PLGA水凝膠將辛伐他汀負(fù)載到3DTi中，從而構(gòu)建辛伐他汀/水凝膠負(fù)載復(fù)合物，通過不同濃度的Sim-3DTi與L929和143 B細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Sim-3DTi有一個合理的濃度（2.5-5 mg/mL），以達(dá)到最佳的生物安全性和抗骨肉瘤作用。在兔髁狀突骨缺損模型和裸鼠骨肉瘤模型中，Sim-3DTi配合合理濃度的辛伐他汀能夠上調(diào)BMP-2的表達(dá)，促進(jìn)成骨，抑制骨肉瘤的發(fā)生，同時保證良好的生物安全性。由于Sim-3DTi結(jié)構(gòu)簡單，生物安全性好，具有明顯的成骨活性和抗骨肉瘤活性，因此它應(yīng)該是一種有前途的骨替代材料，用于修復(fù)骨肉瘤相關(guān)的嚴(yán)重骨缺損。